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产品描述

pGK系列载体是一种高效、精准的基因编辑试剂盒,它是基于最新一代的人工核酸内切酶 CRISPR/Cas9 而研发的,相对于传统敲除技术和 TALENs、ZFNs 技术而言,其操作更加简便,敲除效率高,基因的编辑更加的精准, 大大降低了脱靶机率。该载体能够适用于几乎所有哺乳动物细胞的基因修饰研究。
该系列载体包含 Cas9 核酸酶表达框和 Guide RNA (gRNA) 克隆框,gRNA 克隆框能够快速高效的克隆编 码靶标特异的CRISPR RNA (crRNA)的 DNA 片段。该载体多种筛选标记可供选择,让您仅靠单个载体就可以轻松地完成基因组 DNA 的编辑,实现精准、低 off-target 的基因编辑体验。

产品优势
● 精准的修饰:Cas9 蛋白无特异性,降低脱靶效应,实现精准的基因编辑;
● 敲除效率高:较传统技术和 TALENs、ZFNs 技术,敲除效率高;CRISPR/Cas9 系统的两大功能组件于一 个载体上,转染效率更高;
操作简便:编码 sgRNA 的 DNA 片段小于 100 bp,这些使操作更加简便。

注意事项
因为 Cas9 蛋白比较大,就导致整个敲除质粒较大(10 kb左右),如此大的质粒很容易导致转化效率低下, 尤其是使用脂质体等化学试剂转染时,转染效率会比较低些。所以,我们推荐使用电转的方法进行转染,吉锐生物的Celetrix细胞电转仪(型号CTX-1500A;Cat. No. GP7901,GP7902),电转效率高。

human TMEM187基因为例进行oligo实操设计

1您可以通过以下在线工具设计:

麻省理工学院的CRISPR Designhttp://crispr.mit.edu/

2)选取

ccggttccagATGAATCCAGAGTGGGGGCAGGCCTTCGTGCACGTGGCCGTGGCCGGTGGCCTCTGTGCCGTGG
  CTGTGTTCACGGGCATTTTCGACAGTGTTTCCGTGCAAGTGGGCTATGAGCACTAC

3输入序列信息(以human TMEM187基因为例):一次只能输入23-250bp之间大小的基因片段,好一次只输入一个外显子。

出现下图界面:




4)点提交,出现以下界面(约需几分钟):


5)点Download as genbank


6 点击Download as genbank出现以下界面根据左边不同Guide序列score的高低选取合适的Guide序列,score的高低并不代表敲除效率的高低,所以为提高敲除的成功率,一般选择2-3Guide序列,构建2-3个敲除载体。

Cat.No.

产品名称

规格

备注

GP0134

Genloci CRISPR-Cas9 kit with Puror

5 rxns

动物单敲,Puro抗性

GP0136

Genloci CRISPR-Cas9 kit with Neor

5 rxns

动物单敲,Neo抗性

GP0137

Genloci CRISPR-Cas9 kit with Neor

10 rxns

动物单敲,Neo抗性

GP0133

Genloci CRISPR-Cas9 kit with blank

5 rxns

动物单敲,无抗性

GP0129

Genloci CRISPR-Cas9 kit with EGFP+Puror

5 rxns

动物单敲,EGFP+puro


GP0134-Genloci CRISPR-Cas9 kit with Puro说明书.pdf
GP0136,GP0137-Genloci CRISPR-Cas9 kit with Neo说明书.pdf
GP0133-Genloci CRISPR-Cas9 kit with blank说明书.pdf
GP0129-Genloci CRISPR-Cas9 kit with EGFP+Puro说明书.pdf

Q-1:Genloci Classic CRISPR/Cas9 kit 系列的几款产品之间的区别在哪呢?

A-1:Cat. No. :GP0133~GP0137 都是应用于哺乳动物细胞敲除系统的,其中 GP0133 无特殊筛选标记,应用于瞬时敲除系统,而 GP0134 带有 Puro 抗性,GP0136GP0137 带有 Neo 抗性,GP0129 带有 EGFP+Puro 抗性。添加这些抗性可以对转化效率比较低的细胞进行初筛,以提高阳性克隆筛选的效率。

Q-2:
靶位点设计有哪些注意事项?

A-2:目前有几个在线设计软件,我们推荐使用Zhang Feng labhttp://crispr.mit.edu/,该软件会对每一个潜在的靶位点打分,并告知是否存在脱靶现象。在设计oligo序列时,需要特别注意由于H1 promoter的转录起始位点为A,如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是A,应在设计上游引物时加上一个T。由于U6 promoter的转录起始位点为G,如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G,应自行加一个G上去。另外score的高低并不代表敲除效率的高低,所以为提高敲除的成功率,一般选择3~5Guide序列,先构建3~5个单敲除载体。后续先在pool细胞的基础上验证出有效的位点,再拿有效的两个位点构建双敲载体,做正式电转,筛选单克隆。

Q-3:转染效率低,怎么办?

A-3:因为Cas9蛋白比较大,就导致整个敲除质粒较大(10kb左右),如此大的质粒很容易导致转化效率低下,尤其是使用脂质体等化学试剂转染时,转染效率会比较低些。所以,我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer,所以不推荐使用;LifeNeon系统不错,但是因为耗材是镀金的,所以非常贵;而Genloci的细胞电转仪,转染效率高,一次成本投入,后续转染耗材便宜,操作也方便,尤其适用于难转染的细胞系。

Q-4:
:单个细胞不生长,怎么办?
A-4
:对于单细胞不长的细胞进行敲除,首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞;也可以使用Cell Plaza®(单细胞培养板),可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行,建议对细胞进行改造,加快其分裂速度,让单细胞可以很容易生长后,再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。

Q-5:
:在做高通量样本时,如何才能快速筛选得到阳性克隆?
A-5
:建议使用错配酶进行筛选,可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶:Cruiser®酶、T7E ISurveyor酶。其中,Cruiser®酶和Surveyor酶属于Cel I家族,这两种酶的筛选特异性比T7E I高。在酶切筛选过程中,T7E1的特异性较差,容易出现假阳性的结果,这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度;Surveyor酶较贵,并且货期较长,所以我们推荐Cruiser酶,它特异性高且价格合理。

1. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentie E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptiv bacterial immunity. Science, 2012,337: 816~821.
2. Horvath P., Barrangou R. CRISPR/Cas, the immune system of bacteria and archaea. Science, 2010, 327 (5962): 167~170.
3. Hale CR, Zhao P., Olson S., et al. RNA-Guided RNA Cleavage by a CRISPR RNA-Cas Protein Complex. Cell, 2009, 139 (5): 945~956.
4. Zhang F., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science , 2013, 339(6121): 819~823
5. Westra ER., Swarts DC., Staals RH., Jore MM., Brouns SJ., van der Oost J. The CRISPRs, they are a-changin': how prokaryotes generate adaptive immunity. Annu Rev Genet, 2012, 46: 311~339.
6. Marraffini LA., Sontheimer EJ. CRISPR interference: RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea. Nature Rev Genet, 2010, 11 (3): 181~190.
7. Jiang, W., Bikard, D., Cox, D., Zhang, F., and Marraffini, L.A. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature Biotechnology, 2013, 31: 233~239.
8. Hwang WY., Fu Y., Reyon D., Maeder ML., Tsai SQ., Sander JD., Peterson RT., Yeh JR., Joung JK. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology, 2013, 31:227~229
9. Liu P, Long L, Xiong K, Yu B, Chang N, Xiong JW, Zhu Z, Liu D. Heritable/conditional genome editing in C. elegans using a CRISPR/Cas9 feeding system. Cell Research. 2014, 24(7):886~889.
10. Barrangou R. RNA events. Cas9 targeting and the CRISPR revolution. Science. 2014, 344(6185):707~708. 11. Nishimasu H., et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Cell, 2014, 156(5)935~949