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产品描述

pGK系列载体是一种高效、精准的基因编辑载体,它是基于最新一代的人工核酸内切酶 CRISPR/Cas9 而研发的,相对于传统敲除技术和 TALENs、ZFNs 技术而言,其操作更加简便,敲除效率高,基因的编辑更加的精准, 大大降低了脱靶机率。该载体能够适用于几乎所有哺乳动物细胞的基因修饰研究。
该系列载体包含 Cas9 核酸酶表达框和 Guide RNA (gRNA) 克隆框,gRNA 克隆框能够快速高效的克隆编 码靶标特异的CRISPR RNA (crRNA)的 DNA 片段。该载体含有两个敲除插入位点,可以实现基因片段的敲除,另外,它还含有 Puror 的筛选标记,让您仅靠单个载体就可以轻松地完成基因组 DNA 的编辑,实现精准、低 off-target 的基因编辑体验。


产品优势
● 精准的修饰:Cas9 蛋白无特异性,降低脱靶效应,实现精准的基因编辑;
● 敲除效率高:较传统技术和 TALENs、ZFNs 技术,敲除效率高;CRISPR/Cas9 系统的两大功能组件于一 个载体上,转染效率更高;
● 双敲除:具有两个启动 gRNA 的启动子,两个敲除插入位点,可以实现基因片段的敲除;
操作简便:编码 sgRNA 的 DNA 片段小于 100 bp,这些使操作更加简便。

注意事项
因为 Cas9 蛋白比较大,就导致整个敲除质粒较大(10 kb左右),如此大的质粒很容易导致转化效率低下, 尤其是使用脂质体等化学试剂转染时,转染效率会比较低些。所以,我们推荐使用电转的方法进行转染,吉锐生物的Celetrix细胞电转仪(型号CTX-1500A;Cat. No. GP7901,GP7902),电转效率高。

human TMEM187基因为例进行oligo实操设计

1您可以通过以下在线工具设计:

麻省理工学院的CRISPR Designhttp://crispr.mit.edu/

2)选取

ccggttccagATGAATCCAGAGTGGGGGCAGGCCTTCGTGCACGTGGCCGTGGCCGGTGGCCTCTGTGCCGTGG
      CTGTGTTCACGGGCATTTTCGACAGTGTTTCCGTGCAAGTGGGCTATGAGCACTAC

3输入序列信息(以human TMEM187基因为例):一次只能输入23-250bp之间大小的基因片段,好一次只输入一个外显子。

出现下图界面:




4)点提交,出现以下界面(约需几分钟):


5)点Download as genbank


6 点击Download as genbank出现以下界面根据左边不同Guide序列score的高低选取合适的Guide序列,score的高低并不代表敲除效率的高低,所以为提高敲除的成功率,一般选择2-3Guide序列,构建2-3个敲除载体。




Cat.No.

产品名称

规格

备注 

GP0126

pGK-Blank

4μg

动物单敲,无抗性

GP0131

pGK1.0(Neo)

4μg

动物单敲,Neo抗性

GP0132

pGK1.1(Puro)

4μg

动物单敲,Puro抗性

GP0139

pGK1.2(EGFP+Puro)

4μg

动物单敲,EGFP+puro

GP0127

pGK2.0(Neo)

4μg

动物双敲,Neo抗性

GP0128

pGK2.1(Puro)

4μg

动物双敲,Puro抗性

GP0140

pGK2.2(EGFP+Puro)

4μg

动物双敲,EGFP+puro

GP0126-pGK-Blank说明书.pdf
GP0131-pGK1.0(Neo)说明书.pdf
GP0132-pGK1.1(Puro)说明书.pdf
GP0139-pGK1.2(EGFP+Puro).pdf
GP0127-pGK2.0(Neo)说明书.pdf
GP0128-pGK2.1(Purp)说明书.pdf
GP0140-pGK2.2(EGFP+Puro)说明书.pdf
Q-1:靶位点设计有哪些注意事项?
A-1:目前有几个在线设计软件,我们推荐使用Zhang Feng lab:http://crispr.mit.edu/,该软件会对每一个潜在的靶位点打分,并告知是否存在脱靶现象。在设计oligo序列时,需要特别注意由于H1 promoter的转录起始位点为A,如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是A,应在设计上游引物时加上一个T。由于U6 promoter的转录起始位点为G,如果你选取的Guide序列的第一个碱基不是G,应自行加一个G上去。另外score的高低并不代表敲除效率的高低,所以为提高敲除的成功率,一般选择3~5个Guide序列,先构建3~5个单敲除载体。后续先在pool细胞的基础上验证出有效的位点,再拿有效的两个位点构建双敲载体,做正式电转,筛选单克隆。

Q-2:转染效率低,怎么办?
A-2:因为Cas9蛋白比较大,就导致整个敲除质粒较大(10kb左右),如此大的质粒很容易导致转化效率低下,尤其是使用脂质体等化学试剂转染时,转染效率会比较低些。所以,我们推荐使用电转的方法进行转染。Bio-Rad的电转仪器需要根据不同的细胞单独配制转染buffer,所以不推荐使用;Life的Neon系统不错,但是因为耗材是镀金的,所以非常贵;而Genloci的细胞电转仪,转染效率高,一次成本投入,后续转染耗材便宜,操作也方便,尤其适用于难转染的细胞系。

Q-3:单个细胞不生长,怎么办?
A-3:对于单细胞不长的细胞进行敲除,首先建议采用共培养的方法看看能否促进单个细胞的生长。共培养可以采用培养过同种细胞的培养基培养单细胞;也可以使用Cell Plaza®(单细胞培养板),可以把细胞的存活率提高三倍以上。如果以上方法都不行,建议对细胞进行改造,加快其分裂速度,让单细胞可以很容易生长后,再对目的基因进行敲除。具体方法可以联系Genloci的客服做进一步的了解。

Q-4:在做高通量样本时,如何才能快速筛选得到阳性克隆?
A-4:建议使用错配酶进行筛选,可加快筛选的流程。目前市面上主要有三种错配酶:Cruiser®酶、T7E I和Surveyor酶。其中,Cruiser®酶和Surveyor酶属于Cel I家族,这两种酶的筛选特异性比T7E I高。在酶切筛选过程中,T7E1的特异性较差,容易出现假阳性的结果,这在一定程度上阻碍了阳性克隆的筛选进度;Surveyor酶较贵,并且货期较长,所以我们推荐Cruiser酶,它特异性高且价格合理。