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❀pP1C.7质粒图谱

❀pP1C.7部分序列（U3 Promoter、U6 Promoter及靶点部分）

5’_AAACAGCTATGACATGATGGTACCGGTTCACTAAACCAGCTCTAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTG
ATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCTAGAggcTCTAGATTGCCACGGATCATCTGCACAA
CTCTTTTAAATCAGCTTTGATCTATGTGGATAGCCGAGGTGGTACTAATACTAGTCTTTGTTGTCGTCCAATTGCGTAATGG
GCCGGCCCATACTGCAATACATGTCCTGAAAGGCTTCATGGCCCACTACGAAATGCTTTTCTCCTACAGTTTATCTTACTTC
TTCACATCACGTGGTTTCCAACGTACCCAGTGTTCCCGGCTTCCAGCATTTGCTGGTAGCACCAGTAGTAGTCGCCTGTCT
TGTGCTATGGTCCCTGACTGCACATCTGATTCCTCCAAGATCCATGCATGCCTGATAACTTTAAGTTGCTTCAGAAGAACTTT
AAGTGATCTGTTCGTATGTTTAAAGATCCCTTCATGGTCATAGGCGCGCCTTGTGAAAGTTGAATTACGGCATAGCCGAAGGA
ATAACAGAATCGTTTCACACTTTCGTAACAAAGGTCTTCTTATCATGTTTCAGACGATGGAGGCAAGGCTGATCAAAGTGATCA
AGCACATAAACGCATTTTTTTACCATGTTTCACTCCATAAGCGTCTGAGATTATCACAAGTCACGTCTAGTAGTTTGATGGTACA
CTAGTGACAATCAGTTCGTGCAGACAGAGCTCATACTTGACTACTTGAGCGATTACAGGCGAAAGTGTGAAACGCATGTGATG
TGGGCTGGGAGGAGGAGAATATATACTAATGGGCCGTATCCTGATTTGGGCTGCGTCGGAAGGTGCAGCCCACGCGCGCCG
TACCGCGCGGGTGGCGCTGCTACCCACTTTAGTCCGTTGGATGGGGATCCGATGGTTTGCGCGGTGGCGTTGCGGGGGAT
GTTTAGTACCACATCGGAAACCGAAAGACGATGGAACCAGCTTATAAACCCGCGCGCTGTAGTCAGCTTGGAATTCGTTTTAG
AGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTAGAGCTGG
TTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGT_3’

KpnⅠ位点：GGTACC

灰色底纹标示的序列：分别为gRNA1、gRNA2

XbaⅠ切割位点：黑色方框 TCTAGAggcTCTAGA

OsU3转录起始位点A的互补碱基：T

蓝色底纹标示的序列：OsU3启动子反向互补序列

绿色底纹标示的序列：OsU6启动子序列

OsU6转录起始位点：G

EcoRⅠ-HF切割位点：黑色方框GAATTC

HindⅢ位点：AAGCTT

以拟南芥AtRAN1基因为例进行oligo实操设计

（1）您可以通过以下在线工具设计：

CRISPR Design：http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR

（2）选取

atttttcagGCTCTACCTAACCAGCAAACCGTAGATTATCCCAGCTTCAAGCTTGTCATTGTTGGTGATGGAGGCACAGgtacggt

（3）输入序列信息（以拟南AtRAN1基因为例）

（4）点submit，出现右侧结果；

（5）根据左边不同Guide序列score的高低选取合适的Guide序列，score的高低并不代表敲除效率的高低，所以为提高敲除的成功率，一般选择2-3个Guide序列，构建2-3个敲除载体。

Cat.No.	产品名称	规格	备注
GP0123	pP1C.3	4μg	单子叶植物敲除载体
GP0122	pP1C.4	4μg	双子叶植物敲除载体
GP0120	pPIC.7	4μg	单子叶植物双敲载体
GP0143	pP1C.3 with DNA Recombinase	50 rxns	单子叶植物敲除试剂盒
GP0144	pP1C.4 with DNA Recombinase	50 rxns	双子叶植物敲除试剂盒
GP0119	pP1C.7 with DNA Recombinase	50 rxns	单子叶植物双敲试剂盒

GP0119-pP1C.7with DNA Recombinase（单子叶植物双敲试剂盒）说明书.pdf

Q-1:植物敲除试剂盒中的质粒能否在大肠杆菌中复制扩增？若将载体构建交予你们做，怎么收费？

A-1：试剂盒中的质粒能够在大肠杆菌中复制扩增，若您希望长期使用该质粒，建议在收到货后即转化至大肠杆菌中以利于长期保存和使用。敲除载体构建服务我们的收费标准是1800元/个，完成后仅提供构建完成的敲除载体和测序结果，而不提供构建的原载体以及中间载体。因敲除载体构建的特殊性，我们仅对构建的载体负责，不保证最终的敲除效果；一般的，我们建议设计2~3个不同的靶点对目的基因进行敲除。若您预期长期使用CRISPR/Cas9技术进行基因组编辑，我们推荐能购买试剂盒产品。

Q-2：在进行植物细胞株的敲除载体构建前，还需要做哪些准备工作？

A-2：需要目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要 PCR 扩增靶基因，并对 PCR 结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用 RT-PCR 分析靶基因的活跃度。